English version
На Главную Карта сайта Форма запроса
Искать
 
Сверхкритическая флюидная экстракция

Антимикробная активность сверхкритических экстрактов

Лепешков А.Г., Водяник А.Р., Аверин К.М.
Научно-Исследовательский Центр Экологических ресурсов "ГОРО"
Гапон М.Г., Алешукина А.В.
Научно-Исследовательский институт микробиологии и паразитологии
г. Ростов-на-Дону


Сырье растительного происхождения может служить практически неисчерпаемым источником биологически активных веществ (БАВ), которые, в свою очередь, находят применение в различных областях современной промышленности. Для выделения биологически активных компонентов можно применять различные экстракционные методы обработки растительного сырья, однако в последнее время наметилась тенденция использования в этих целях сжиженных и сжатых газов и, в частности, диоксида углерода. Экстрагирование БАВ преследует цели не только их извлечения и концентрирования, но и позволяет в ряде случаев получить активные компоненты в более удобной для использования форме.

В нашем Центре для получения экстрактов из растительного сырья применяются установки, использующие в качестве растворителя диоксид углерода в сверхкритическом состоянии. В этом случае углекислый газ приобретает универсальные растворяющие способности, что приводит к наличию в конечном экстракте такого широкого спектра биологически активных соединений, какой недостижим, пожалуй, ни одним из применяющихся в современной промышленности методов экстракции. Более того, одним из преимуществ данного метода является отсутствие в конечном экстракте каких бы то ни было следов растворителя, а технологические параметры процесса позволяют сохранить в экстракте все извлекаемые компоненты в натуральном виде. Интересным может оказаться и то, что предлагаемая технология может использовать в качестве сырья для получения биологически активных экстрактов уже отработанные или нетрадиционные источники веществ, обладающих фармакологическим эффектом.

Экстракты, полученные с помощью диоксида углерода, находящегося в сверхкритическом состоянии, имеют достаточно сложный химический состав, и его изучение может явиться предметом отдельного исследования. В нашей работе мы пока не можем претендовать на абсолютную полноту химического анализа экстрактов, полученных в нашем Центре при помощи технологии сверхкритической экстракции, однако результаты уже проведенного анализа позволяют сделать вывод, что эта технология может обеспечить выделение из исходного растительного сырья большого спектра биологически активных соединений.

Так, например, в сверхкритическом экстракте шалфея лекарственного (Salvia officinalis) в большом количестве были обнаружены терпеновые соединения (цинеол, туйон и его производные, кариофиллен, камфора, борнеол, ледол и др.), высокомолекулярные жирные кислоты (в том числе и линолевая и линоленовая), витамин Е, а также стероидные соединения. В составе экстракта эхинацеи пурпурной (Echinacea purpurea) больше половины состава высших жирных кислот приходится на долю линолевой и линоленовой кислот (свыше 80%), выявлены стероидные соединения (ситостерол).

В данной работе мы не ставили перед собой задачи полной расшифровки химического состава получаемых экстрактов, тем более что на основании только химического анализа весьма сложно судить об их биологической активности. Тем не менее представляется очень интересным рассмотреть получаемые экстракты именно с этой точки зрения.

Хорошо известно, что шалфей обладает противомикробным и противовоспалительным эффектом, и может использоваться при лечении труднозаживающих и гнойных ран. Для препаратов эхинацеи характерны иммунокорректирующие свойства, хотя не исключается и антибактериальное и противовирусное действие.

Свойства сверхкритических экстрактов в плане их микробиологической активности практически пока неизвестны, поэтому в предварительных экспериментах изучали антимикробную активность сверхкритических экстрактов шалфея и эхинацеи.

При проведении экспериментов по изучению антимикробной активности экстрактов использовали следующие культуры микроорганизмов:

1. Staphylococcus aureus
2. Escherichia coli
3. Clebsiella pneumonea
4. Shigella sonnae
5. Proteus vulgaris
6. Proteus mirabilis
7. Salmonella typhimurium
8. Serracea marcescens
9. Грибы рода Candida (Candida albicans)

Исследование микробиологической активности экстрактов проводили тремя независимыми методами. На наш взгляд подобный подход позволяет исключить возможное влияние методических особенностей используемых методов на конечный результат экспериментов.

Для метода индикаторных дисков культуры микроорганизмов выращивали на мясопептонном агаре, грибы рода Candida - на среде Сабуро. Для растворения экстрактов был использован хлороформ. Диски готовили по общепринятой методике; контролем служили диски, пропитанные хлороформом. Суточные агаровые культуры смывали стерильным физиологическим раствором, разводили взвесь по стандарту мутности до 10 ед., по 1 мл взвеси засевали газоном на чашки с мясопептонным агаром и средой Сабуро. На подсушенную поверхность раскладывали индикаторные диски, раскапывали по 0,05 мл разведений экстрактов. Посевы помещали в термостат при температуре 37 °C на 18 - 20 часов, посевы с грибами рода Candida - при температуре 22 °C на 5 суток. При учете результатов определяли зоны задержки роста культур микроорганизмов вокруг диска с разведением экстрактов. Результаты эксперимента приведены в табл.1

Таблица № 1.
Антимикробная активность экстрактов при определении методом дисков

Экстракты эхинацея шалфей
Культуры 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
St. aureus - - - - - - - - - - - +
E.coli - - - - - - - - - - - -
K. pneum. - - - - - - - - - - - -
Sh.Sonnae - - - - - - - - - - - -
Pr.vulgare - - - - - - - - - - - -
Pr.mirab. - - - - - - - - - - - -
Sal.typh. - - - - - - - - - - - -
Ser.marc. - - - - - - - - - - - -
C.albicans - - - + + + - ± + + + +

Условные обозначения:
Концентрация экстрактов: 1 - 1.5%; 2 - 3%; 3 - 6%; 4 - 12.5%; 5 - 25%; 6 - 50%
- отсутствие задержки роста
± зона задержки роста до 10 мм
+ зона задержки роста 10 мм и выше

Результаты эксперимента показывают, что при использовании дисков антимикробная активность выявляется в основном в отношении грибов рода Candida, хотя экстракт шалфея мог угнетать развитие стафилококка золотистого. Интересным оказалось то, что развитие грибов рода Candida подавлялось при сравнительно низких концентрациях экстракта на диске.

Так как недостаточное антимикробное действие экстрактов могло быть обусловлено их слабой диффузией с диска в агар, было проведено дополнительное исследование методом "скользящей капли".

Таблица № 2.
Антимикробная активность экстрактов при определении методом "скользящей капли"

Микроорганизмы St.aureus E.coli Sh.sonnea Pr.vulg. Pr.Mirab. Ser.Marces. Kl.Pneum. Sal.Typh. Candida
Экстракты:
Шалфей + + + + + + + + +
Эхинацея - - - - - - - - -

Условные обозначения:

- отсутствие задержки роста
+ выраженная задержка роста

Данные, представленные в табл.2 показали, что взятые в эксперимент экстракты обладают разной степенью антимикробной активности. Наибольшую активность в отношении практически всех использованных в опытах культур микроорганизмов обнаруживает экстракт шалфея, тогда как экстракт эхинацеи развитие микроорганизмов не останавливает.

При исследовании активности экстрактов на жидкой питательной среде культуры микроорганизмов засевали по 0.1 мл взвеси в физиологическом растворе (смыв с агара, отстандартизованный на 10 ед. мутности по оптическому стандарту мутности). В опытные пробирки добавляли по 1 мл экстракта. Взвесь тщательно перемешивали стерильной пипеткой и помещали в термостат при температуре 37 °C на 24 часа (в случае грибов рода Candida - до 5 суток при температуре 22 °C). После инкубации стандартизованной петлей проводили высевы из всех пробирок на соответствующие питательные среды. Результаты учитывали путем подсчета выросших колоний.

Таблица № 3.
Антимикробная активность экстрактов, определяемая в жидкой среде

Экстракты Контроль Шалфей Эхинацея
Микроорганизмы Кол-во колоний Кол-во колоний Кол-во колоний
St.aureus Более 1000 1 Более 1000
Ser.marcescens Более 1000 2 Более 1000
Sal.typhimirium Более 1000 Более 1000 Более 1000
Kl.pneumonea Более 1000 До 500 Более 1000
Sh.sonnae Более 1000 До 500 Более 1000
E.coli Более 1000 Более 1000 Более 1000
Pr.vulgaris Более 1000 До 400 Более 1000
Pr.mirabilis Более 1000 До 400 Более 1000
C.albicans Более 200 6 Более 200

Приведенные в табл.3 результаты подтверждают наблюдения, полученные в предыдущих опытах. Экстракт шалфея обнаруживает антимикробную активность в отношении стафилококка, серрации, грибов рода Candida. Значительно более слабая активность экстракта шалфея выявлена в отношении протеев. Экстаркт эхинацеи не обнаруживает антимикробного действия по крайней мере в отношении исследованных бактерий и грибов.

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что сверхкритические экстракты могут обладать значительной антимикробной активностью. Несколько неожиданным оказалось влияние экстракта шалфея на штамм грибов рода Candida, но это может быть следствием наличия в экстракте большого спектра биологически активных соединений, выделяемых из исходного растительного сырья с помощью диоксида углерода, находящегося в сверхкритическом состоянии. Полученные результаты позволяют говорить о том, что сверхкритические экстракты даже уже сравнительно хорошо изученных растений могут обладать новыми свойствами, и именно поэтому данная работа может и должна быть продолжена.



Назад  Вверх Версия для печати
Copyright © 2001-2018 Группа компаний «ГОРО»
Сделано в студии «RU-WEB»